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CONSEJO SUPERIOR DE
INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS


Impacto biológico de la biorremediación Histopatología Inmunología

Ensayos de biorremediación en la Isla de Sálvora. III: Bioseguridad. Enfoque histológico e inmunológico

 

Instituto de Investigacións Mariñas (CSIC). Vigo
Grupo de Patología de organismos marinos - A.Figueras, B.Novoa y C.Ordás

 

MEJILLONES DE SALVORA

•  Estudios de Histopatología

   

1. 1) Metodología.

Se fijó el cuerpo entero de los mejillones en fijador Davidson durante 24 horas (Shaw & Battle, 1957) en una relación 1:5 (volumen de muestra:solución fijadora) para así permitir una buena fijación de todos los tejidos. Transcurridas las 24 horas de fijación, las muestras se pasaron a una solución conservante donde permanecieron hasta su posterior deshidratación e inclusión en parafina.

De cada mejillón se hicieron cortes transversales oblicuos de 5 mm aproximadamente de ancho, de tal forma que quedaran incluidos todos los órganos (glándula digestiva, estómago, intestino, gónada, manto branquia, riñón y músculo) en el mismo corte. Los cortes fueron deshidratados e incluidos en parafina en un histokinette Reichert-Jung 2000.

Después de la inclusión en parafina, se realizaron cortes transversales de 5 m m de grosor en un microtomo. Previo a la tinción, las secciones fueron desparafinadas para facilitar la penetración de los colorantes en los cortes de tejido. Posteriormente, las secciones se hidrataron en sucesivos baños de alcohol y se tiñeron con hematoxilina-eosina. Por último, el montaje de los cubreobjetos se realizó con una resina sintética (Permount). Las preparaciones se dejaron secar a temperatura ambiente para su posterior observación al microscopio óptico (Nikon).

•  2) Resultados.

La proporción de sexos así como el grado de desarrollo gonadal fueron los esperados. En cuanto a los posibles patógenos presentes en los tejidos de los mejillones analizados, detectamos en relativamente altas concentraciones la presencia de los siguientes organismos:

•  Nematopsis : parásito perteneciente al phylum Apicomplexa, clase gregarina, presente en la mayoría de los órganos, principalmente en las branquias

•  Trematodos : metazoos que pueden llegar a impedir la maduración gonadal tanto a través de la competencia física por el espacio en la gónada de los mejillones como mediante competencia energética

También observamos la presencia de otros agentes patógenos, aunque en menor prevalencia que los anteriores:

•  Chlamidias : parásitos intracelulares que consisten en pequeños cuerpos esféricos de inclusiones basofílicas. En los mejillones observados, estos organismos se encontraron principalmente en las células de los túbulos digestivos.

•  Ciliados : protozoos que viven fundamentalmente en las branquias de los moluscos bivalvos, lugar en el que se aprovechan del flujo de alimento y también se observan esporádicamente en la glándula digestiva

•  Mytilicola : copépodo presente fundamentalmente en el tracto digestivo.

Por otra parte, también encontramos los siguientes tipos de anormalidades en los tejidos de algunos mejillones:

•  Infiltración hemocitaria : debido a que los moluscos bivalvos poseen un sistema circulatorio abierto, es normal encontrar células sanguíneas (hemocitos) libres en los tejidos de estos animales. Sin embargo, si su número crece anormalmente se considera indicio de lesión, posiblemente relacionada con la contaminación.

•  Granulocitomas : consisten en acumulaciones anormales de granulocitos. Este tipo de lesión ha sido relacionada en distintas investigaciones con la contaminación por hidrocarburos, metales pesados e incluso con infecciones víricas.

A pesar de la presencia de diversos agentes patógenos en los tejidos de los mejillones, algunos con prevalencias considerables, las lesiones tisulares observadas eran debidas únicamente a las metacercarias de trematodos, localizadas principalmente en el pie del hospedador.

Como conclusión, podemos afirmar que no se apreciaron lesiones asociadas a las bacterias empleadas en las tareas de biorremediación.

Los resultados se resumen en las Tablas que se adjuntan.

Tabla 1 . Sexo (%).

 

Muestra/Estadio

N. individuos

Indeterminado

Macho

Hembra

O mes

28

3

54

43

1 mes

28

0

46

54

2 meses

28

0

70

30

Tabla 2 . Estadios gonadales (%).

 

Muestra/Estadio

N. individuos

1

2

3

4

O mes

28

0

18

75

7

1 mes

28

0

29

50

21

2 meses

28

4

22

53

21

Tabla 3 . Prevalencia (%) de agentes patógenos observados en los tejidos.

 

Muestra/Estadio

Chlamidias

Nematopsis

Ciliados

Trematodos

Mytilicola

O mes

4

36

4

39

8

1 mes

0

32

0

39

4

2 meses

4

14

0

7

4

Tabla 4 . Lesiones (%) observadas en los tejidos.

 

Muestra

Infiltración

Granulocitomas

 

1

2

1

2

O mes

25

10

4

0

1 mes

21

14

4

0

2 meses

7

0

0

0

 

  •  Pruebas Inmunológicas

  2. 1) Metodología.

Para determinar el estado del sistema inmune de los mejillones recibidos en el laboratorio, se midieron los siguientes parámetros inmunes:

•  Actividad lisozima del suero : las lisozimas son 1,4- b - N- acetilmuramidasas que rompen el enlace glicosídico entre el C- 1 del ácido N- acetilmurámico y el C- 4 de la N- acetilglucosamina en el péptidoglucano bacteriano, principal polímero estructural de la pared celular bacteriana. La lisozima se almacena en los lisosomas que contienen los gránulos de los hemocitos granulares, y se libera al suero sin ruptura de la membrana plasmática en el proceso de desgranulación. Este fenómeno, habitual en los hemocitos de los moluscos, es estimulado con la fagocitosis de bacterias. El nivel de lisozima en el suero de los bivalvos se encuentra fuertemente condicionado por la estación, el estrés y el ciclo mareal. Para medir esta actividad en el suero de los mejillones, se incuba la bacteria Micrococcus lysodeikticus con el propio suero y se mide la disminución de absorbancia asociada a la lisis de la bacteria durante cinco minutos. Las actividades lisozimas se convierten a concentraciones de lisozima usando como estándar lisozima de clara de huevo.

•  Viabilidad de los hemocitos : la unidad de defensa celular de los moluscos bivalvos es el hemocito, responsable de mecanismos de defensa tan importantes como la fagocitosis, la liberación de radicales tóxicos de oxígeno (estallido respiratorio) o de nitrógeno, y la encapsulación. Además, está íntimamente ligado a los mecanismos de defensa humoral, como son la actividad lisozima del suero, la hemaglutinación o el sistema profenoloxidasa. Por tanto, la capacidad defensiva de un molusco bivalvo depende en gran medida de la integridad de estas células sanguíneas. Para medir la viabilidad de los hemocitos de los mejillones muestreados, empleamos un ensayo en microplaca basado en la absorción de rojo neutro por parte de los hemocitos vivos, midiéndose posteriormente la absorbancia del rojo neutro incorporado a las células.

•  Estallido respiratorio medido como emisión de quimioluminiscencia frente a un estímulo particulado (zimosán): la estimulación de los fagocitos por perturbaciones de los receptores de la membrana o por ingestión de partículas extrañas produce un aumento del consumo de oxígenos debido a la activación de los enzimas NAD(P)H- oxidasa y mieloperoxidasa (MPO). La actividad de estos dos enzimas transforma el oxígeno molecular los radicales tóxicos de oxígeno (ROIs), que son potentes efectores destructivos que pueden funcionar independientemente o en asociación con los enzimas lisosómicos. La quimioluminiscencia (CL) permite la medición del estallido respiratorio intracelular y extracelular, puesto que los ROIs liberan fotones simples durante su vuelta al estado basal, además de oxidar moléculas no tóxicas como por ejemplo el luminol. Los ensayos de CL utilizan esta molécula para aumentar la emisión de fotones por parte de las células sanguíneas hasta un nivel detectable en un luminómetro. En nuestro caso, añadimos a los hemocitos de los mejillones un estímulo particulado (zimosán) así como luminol, y medimos la emisión de CL en un fluorímetro luminómetro durante 30 minutos a intervalos de 5 minutos.

2. 2) Resultados.

No se detectaron diferencias significativas entre los mejillones muestreados cada mes en Sálvora para ninguno de los parámetros inmunes medidos.

 

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